细胞 （2 × 105将细胞/mL）接种在12孔板（1mL /孔）中■★■★◆，底部有盖玻片。在不同培养时间用COD悬浮液共培养后，去除盖玻片◆★◆，并用D-Hank溶液冲洗掉非粘附晶体★■■◆◆◆。 对于SEM观察，用2■★◆■.5%戊二醛在4°C下固定盖玻片上的细胞和晶体24 h■◆，在乙醇梯度（30%，50%，70%◆■★■◆，90%和100%）中脱水，用乙酸异戊酯重新固定，在二氧化碳临界点下干燥◆★★◆■■，然后用金溅射处理★■◆。通过SEM观察到细胞和晶体之间的粘附★◆。 为了进行ICP检测，将盖玻片取出并放置在25 mL烧杯中。然后★■◆，加入10 mL硝酸和0■★★■◆.5 mL高氯酸，并将样品在电炉上消化，直至形成澄清溶液★◆★◆■■。将样品连续加热，直到高氯酸沸腾，冒烟并几乎干燥。电炉的余热用于干燥样品，然后在室温下冷却。此后向烧杯中加入3 mL水以溶解残留物★★■★◆。钙的浓度 2+ 在溶液中使用ICP法进行测量★◆■。根据Ca的浓度计算相关COD微晶的数量 2+ 离子◆■◆，结果以μg/cm表示 2 .
在2-6小时时，只有少量的COD微晶粘附在细胞表面（ 图 2A 和 B ).此外，尽管保留了纺锤体形状，但观察到细胞形状的轻微变化★■◆。这一发现表明，对照组COD微晶与Vero细胞的粘附能力非常弱。 但是，在 12 小时（ 图 2C ） 和 24 小时 （ 图 2D ）■■★，COD微晶的粘附量明显增加，细胞开始收缩。
图 6 激光扫描共聚焦显微镜图像（×630）显示◆★◆◆◆，在（A）0小时■◆，（B）6小时★★，（C）12小时和（D）24小时草酸钙二水合物与损伤组中上皮细胞粘附后，骨桥蛋白对非洲绿猴肾上皮细胞的荧光变化◆★■◆。注意：细胞核为蓝色，表达的骨桥蛋白为绿色◆◆★■★。 更多的OPN分子在粘附前由损伤组中的Vero细胞表达（ 图5A和6安培 ），相对表达水平为1134（P0.01），远高于对照组Vero细胞的相对OPN表达水平321■◆★。
图2 扫描电镜图像（比例尺= 10μm）草酸钙二水合物与对照组中非洲绿猴肾上皮细胞粘附后（A）2小时◆■■★★◆，（B）6小时★★■，（C）12小时和（D）24小时★★★★◆◆。
如 图 6 0~6 h时★★，OPN在细胞表面的荧光强度逐渐减弱★■■◆■，6 h时达到602（P0◆◆■◆.05），与对照组的变化趋势完全相反。这一发现的原因是受损细胞高度表达的OPN分子具有非常强的粘附能力，并且可以在相对较短的时间内（6小时）完全粘附COD到饱和粘附状态★■■◆。当OPN分子被COD粘附时★★■★■，可以与荧光抗体结合的暴露OPN分子会减少★◆■★■，导致荧光减弱。OPN产量的减少也是由细胞死亡引起的，细胞死亡不能正常工作。26 受损细胞的凋亡和坏死率分别为4.6%和1.4%■★。这些数据都高于对照细胞（2.8%和1.31%）。 27 细胞活力、MDA含量和OPN表达水平的结果表明★■■★，亚微米COD在粘附过程的前6小时内会严重损害Vero细胞★★■★。这一结论与以前的报告不一致。19 – 21 肾上皮细胞暴露于CaOxa晶体会增加单核细胞化学吸引蛋白-1和前列腺素的合成，两者已知都参与炎症过程。28 因此，除了上述不同空白值的选择外★◆■■★◆，这种不一致也可以归因于Vero细胞对亚微米COD（150±50nm）的强内吞能力★★★■，这很容易诱导炎症反应★◆★。随着附着时间的延长，亚微米COD逐渐聚集成微米级晶体（ 图 2 和 3 ）★◆◆◆，从而减少其细胞损伤效应。
实验如前所述进行。 15 将细胞悬浮液接种在合适的平板中，并在37°C下孵育24小时■■◆◆★，具有5%的二氧化碳和饱和湿度。24小时后■■■★★■，将培养基更换为无血清培养基，并将细胞孵育12小时以实现同步（总孵育时间为36小时）。然后将细胞分为A组和B组。A组（对照组）的细胞仅暴露于无血清培养基★◆，而B组（损伤组）的细胞用0.3mmol / L过氧化氢损伤。向两组加入含有COD微晶（浓度为100μg/mL）的无血清培养基。在粘附2◆★◆★■，6，12，18和24小时后◆★★，使用细胞计数Kit-8方法测定细胞活力。用MDA测试试剂盒测定丙二醛（MDA）含量★◆◆■。通过荧光定量法测定细胞表面的OPN表达。使用纳米颗粒尺寸分析仪测定COD晶体的zeta电位◆■★★◆。通过SEM观察Vero-COD粘附，并通过ICP定量分析粘附COD微晶的量■■◆■★■。
Vero细胞是从中国科学院上海细胞库购买的（由中国广州暨南大学生物医学研究与发展中心Yi-Fei Wang教授捐赠）◆■。Dulbecco的改良Eagle培养基：营养混合物F12来自Thermo Scientific HyClone（犹他州洛根），Gibco新生儿小牛血清来自Life Technologies（加利福尼亚州卡尔斯巴德）。骨桥蛋白（OPN）和荧光素异硫氰酸酯二抗的一抗来自圣克鲁斯生物技术（加利福尼亚州圣克鲁斯）。细胞增殖检测试剂盒（细胞计数试剂盒-8）来自Dojindo实验室（日本熊本）。MDA套件来自建城生物技术研究所（中国南京）。磐城细胞培养板来自AGC Techno Glass（日本千叶）。所有其他试剂均为分析纯品级。®® XL-30环境扫描电子显微镜（SEM）来自飞利浦（荷兰埃因霍温）。纳米颗粒尺寸的zeta电位分析仪（Zetasizer Nano ZS）来自Malvern Instruments Ltd（英国莫尔文）◆■■。激光共聚焦显微镜（LSM;510 META duo scan）来自Carl Zeiss AG（德国Oberkochen）。酶标记仪器Safire™来自Tecan Group Ltd（瑞士曼内多夫）。Optima™ 2000 DV电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP）来自PerkinElmer（马萨诸塞州沃尔瑟姆）。粉末X射线衍射（XRD）结果在D / max-γA X射线衍射仪（理学公司◆◆■■■★，日本东京）上使用镍过滤铜Kα辐射（λ = 1■■★.54 Å）和2度/分钟的扫描速率在40 kV，30 mA下记录◆◆■★。在5度至60度2θ的范围内，发散和散射狭缝为1度。IFS25傅里叶变换红外光谱仪（FT-IR）来自布鲁克SA（法国Wissembourg）。扫描范围为 4000–400 cm®−1分辨率为0■★★■★.5厘米−1.CaOxa的形态根据King等人确定， 14 COD与美国测试和材料协会卡号17-541进行了比较。离心机来自Eppendorf（5804 R★◆■■★◆，德国）■◆★◆。
图 8 草酸钙二水合物微晶在不同粘合时间粘附在细胞表面的量。缩写：h，小时。 对照组COD与Vero细胞粘附过程中◆◆★■■◆，SEM图像上MDA含量、OPN表达和粘附微晶量的比较以及ICP结果显示，在粘附的早期阶段（2~6 h）◆■◆◆★◆，MDA含量（ 图 4B ） 和 OPN 表达式 （ 图 4C ） 迅速增加。相比之下，COD在Vero细胞表面的粘附量仅在12小时后显着增加（ 图2C、D 和 8 ).这一结果的原因是对照组的细胞在与COD微晶相互作用6小时后明显受损■■◆★，导致MDA含量和OPN分子表达升高◆★■◆。然而，COD和Vero细胞之间的粘附是一个从定量到质变的过程■★◆◆■◆。细胞损伤后★■★，粘合剂分子（如OPN和磷脂酰丝氨酸）被表达出来。然而，细胞表面这些分散的OPN和磷脂酰丝氨酸分子不易粘附在COD微晶上。只有当这些带负电荷的分子聚集在一起并形成高密度的负电荷区域时，它们才能有效地结合COD晶体。 25 同时，粘附量的增加被推迟了，因为这些分子需要一些时间才能聚集在一起★■◆◆◆★。 OPN和其他带负电荷的分子的表达是增强损伤Vero细胞粘附能力的重要原因■◆。OPN的分子链中含有一个富含天冬氨酸的区域，称为poly-Asp86-93结构域。Chien等人报道◆◆◆■，poly-Asp86-93结构域是OPN分子和COD晶体相互作用的中心◆★。 35 具有高电荷密度的Poly-Asp86-93肽在溶液中呈线性和非结构化◆■◆■★◆，其功能侧链没有特定的方向。然而，聚Asp86-93肽在吸附在（110）面Ca之后，可能会以各种构象粘附在晶体表面上。2+-丰富的COD晶体的晶体平面。这种粘附主要通过天冬氨酸和Ca中四个或五个羧基之间的强静电组合介导的。2+晶体表面上的离子◆◆■◆■★。他们的晶格匹配度也很高◆◆◆■★■。 在没有尿石症的正常个体的尿液中，细胞表面对COD微晶的粘附能力非常弱，因为它们的肾小管上皮细胞没有受伤◆★。然而◆■◆■，患有肾结石的患者的肾小管上皮细胞经常受伤■★◆■◆■。结果，微晶与损伤细胞之间的粘附力大大增强。粘附的晶体会对肾小管上皮细胞产生进一步的损害，从而增加肾结石形成的风险★◆■。 转到(G)：
损伤组150±50 nm的亚微米COD与损伤组Vero细胞的粘附能力明显强于对照组COD和Vero细胞，特别是在前6h◆★。结果，粘附在细胞表面的COD微晶量明显增加，zeta电位升高，荧光强度降低，因为OPN分子被COD覆盖■■★■，死亡细胞不能正常工作。
以亚硝基三乙酸为络合剂■◆，采用络合沉淀法制备了亚微米COD晶体和COD悬浮液■◆。即0.3 mol/L氯化钙与等量的亚硝基三乙酸混合，然后以1 mL/min的速度加入0.3mol/L草酸钾，在75°C下快速搅拌。静置30分钟后，通过离心分离沉淀，用蒸馏水洗涤两次，然后真空干燥。通过SEM，XRD和FT-IR确定产品的特性。COD微晶的平均尺寸为150±50 nm■◆。使用终浓度为100μg/ mL的无血清培养基制备COD悬浮液★◆◆◆。
通过SEM观察COD微晶在对照组和损伤组Vero细胞上的粘附。结果显示在 图 2 和 3 ★◆◆■◆◆.
Vero细胞与0■★◆◆.3 mmol/L过氧化氢孵育1小时后，受到氧化损伤◆★★◆◆，引起形态变化。对照组中的大多数Vero细胞表现出典型的纺锤形，具有完全完整的形态和微绒毛（ 图 2A ).然而，过氧化氢损伤后细胞萎缩，伴有微绒毛（ 图 3A )◆★◆.损伤后◆★◆，细胞活力由100%（对照组）下降到70.5%（P0.05）。
图3扫描电镜图像（比例尺= 10μm）在（A）2小时，（B）6小时◆★■■■◆，（C）12小时和（D）24小时与损伤组中的非洲绿猴肾上皮细胞粘附后草酸钙二水合物■★★★。 在SEM插图中没有观察到交汇点配合物。此结果可能归因于以下原因。首先★◆◆◆，在样品制备过程中经过一系列洗涤★◆◆，脱水和干燥后，样品经历了细胞损失和细胞尺寸减小。一些紧密的路口也断裂了。其次，为了澄清细胞 - 晶体粘附的细节，一些细胞相对稀疏的区域被人为地选择然后拍照。第三，内吞作用早在细胞暴露于晶体后30分钟就发生了。 17 在内吞作用期间，形成的细胞 - 晶体复合物似乎与单层分离◆■■，并且在细胞 - 细胞接触区域出现大间隙■◆◆★。
如 图 5 OPN在0~6 h时细胞表面的荧光强度随粘附时间的增加而增加★■★★■，6 h时达到最大值902（P 0★◆★★.01）。这一发现可能归因于粘附开始时COD诱导的损伤水平高，导致OPN分子在Vero细胞上的表达升高和荧光强度增强。该结果与细胞活力（ 图 4A ） 和 MDA 测量值 （ 图 4B ). 在6-24小时，OPN的荧光强度降低（ 图 4C ）因为富含在Vero细胞表面的OPN分子粘附在COD上，导致OPN分子与荧光抗体的结合减少，从而削弱OPN荧光强度。
图 4 （A）细胞活力，（B）丙二醛含量，（C）骨桥蛋白表达和（D）玉米蛋白电位在控制组和损伤组中草酸钙二水合物微晶和非洲绿猴肾上皮细胞粘附过程中的变化■■★◆★。 注：*P 0.05;P0.01与未暴露于草酸钙二水合微晶的细胞相比。# 缩写■◆◆★★★：h，小时◆◆■;MDA，丙二醛。然而★■，以前的报告显示，COD微晶只会对细胞产生轻微的损害或没有损害◆■★■，COD甚至可以促进细胞增殖。19 , 20 在这些报告中，选择0小时时的细胞活力作为空白值。由于细胞（包括对照组和损伤组）具有较强的自修复能力和自增殖能力，随着粘附时间的增加，自增殖的细胞活力值增加。它甚至大于COD诱导的细胞损伤引起的活力值降低。这种现象导致在一定时间内粘附到COD后■◆■◆，细胞活力出乎意料地增强◆■■★★，从而得出“COD微晶可以促进细胞增殖”的结论。19 , 20 事实上，对COM微晶的研究也显示了类似的结果■◆■。19 , 21 然而，在这项研究中，细胞活力的空白值是在没有微晶添加的情况下孵育24小时后的空白值。不同粘附时间（24、18、12、6 和 2 小时）的实验分别从 0、6■★◆、12、18 和 22 小时开始★★■。在24小时◆◆，终止所有粘附实验★★★，同时测定每组的细胞活力。通过这种设计★◆★★■，结果可以反映COD微晶对细胞活力的影响，因为细胞自增殖的影响在很大程度上被消除■◆★■◆。当前研究结果与先前研究结果之间的差异 19 ★★■★■, 20 也可能归因于其他原因。例如★★★，不同的细胞系在与CaOxa晶体相互作用时可能表现不同。在以前的研究中，使用了人肾-2细胞和Madin-Darby犬肾细胞，19 , 20 而Vero细胞用于目前的研究。此外■★★，还使用了不同尺寸的CaOxa晶体。先前研究中使用的晶体的平均尺寸分别超过20μm和0.7（0.4-2.0）μm， 19 , 20 两者都比当前研究中使用的亚微米晶体大得多。因此★◆■，实验结果（ 图 4A ）与前几次报告的结论完全不同。 19 , 20
损伤组150±50 nm的亚微米COD与损伤组Vero细胞的粘附能力明显强于对照组COD和Vero细胞，特别是在前6h。结果，粘附在细胞表面的COD微晶量明显增加，zeta电位升高，荧光强度降低■■◆◆，因为OPN分子被COD覆盖贝斯特全球最奢游戏最新★★★■，死亡细胞不能正常工作。在粘附过程中◆★■★，COD微晶可能会对对照和损伤的Vero细胞产生进一步的损伤。结果，粘附在受伤上皮细胞上的COD微晶量增加，这在早期肾结石的形成中很重要。本研究的结果表明，采取干预措施预防或减轻肾小管细胞损伤的有效方法，可预防早期肾结石形成。
通过ICP（ 图 8 ).损伤组粘附的微晶量显著高于对照组。特别是12小时后，差距进一步扩大■★★。而且，粘附在对照组的COD微晶量随粘接时间的延长而缓慢增加◆■■■★■，而粘附在损伤组上的COD微晶量随时间推移迅速增加■◆◆。
图 7 显示了不同时间粘附后对照组和损伤组维罗细胞内吞的COD晶体的SEM图像★★◆■■★。结果表明■★◆■，正常的Vero细胞具有更强的吞噬能力。然而，受伤的Vero细胞粘附微晶的能力增强★◆★■。此外，它们吸收微晶的能力减弱。
损伤组Vero细胞与COD微晶的粘附能力明显强于对照组。随着粘合时间的增加，粘合量迅速增加（ 图 3 ).特别是，在 12 小时（ 图 3C ） 和 24 小时 （ 图 3D ），许多COD微晶粘附在受伤的Vero细胞的表面■★★★◆。
图 7 在（A和B）对照组和（C和D）损伤组粘附后★■■，由非洲绿猴肾上皮细胞内吞的草酸钙二水合物晶体的扫描电镜图像（比例尺= 2μm）在（A和C）6小时和（B和D）24小时粘附后。 肾小管上皮细胞损伤可增强肾小管上皮细胞与尿液微晶的粘附。 31 然而，肾小管上皮细胞没有被动地接受损伤。肾小管上皮细胞可以内化一些粘附的晶体■■◆◆★。一旦进入细胞，晶体将不再暴露于过饱和管状流体或作为晶体聚集的潜在位点，这被视为防止结石形成的单独防御。 32 ■★■◆, 33 Lieske等人通过SEM和TEM证明◆◆■◆，在COM晶体粘附在BSC-1细胞（非洲绿猴肾脏起源的上皮细胞系）的顶端表面的微绒毛上后，内吞作用早在细胞暴露于晶体后30分钟就发生了内吞作用。 17 许多研究表明★◆，细胞损伤可能是由晶体内吞作用引发的。 17 ■◆◆◆, 18 , 34 COM晶体可以单独主动内吞◆■■◆，也可以由Madin-Darby犬肾细胞作为聚集体。 22 晶体与表面的微绒毛和纤毛混合◆■★◆★，相邻的细胞在结构上发生了变化★◆◆。
图 5 激光扫描共聚焦显微镜图像（630×）显示◆★★★★■，在（A）0小时◆◆，（B）6小时■◆◆■★★，（C）12小时和（D）24小时草酸钙二水合物与对照组中的上皮细胞粘附后，非洲绿猴肾上皮细胞上骨桥蛋白的荧光变化。注意■■◆★◆：细胞核为蓝色■■，表达的骨桥蛋白为绿色。
图 1A 显示了亚微米COD晶体的SEM图像。与微米级的COD不同，一些亚微米COD没有显示出四角双金字塔的典型形态。COD的尺寸范围为100-200 nm，平均约为150 nm◆◆。
粘附过程中MDA含量的测量进一步支持了COD微晶可能损伤Vero细胞的结论。结果显示在图 4B . 粘连前（即0 h时），对照组Vero细胞释放的MDA含量为2.91 nmol/mL◆◆■■★■，损伤组增至8.06 nmol/mL（P0◆■◆◆■.01）。MDA含量升高是细胞氧化损伤的明显征兆。 22 ◆◆◆, 23 该结果与细胞活力测定（ 图 4A ）◆★■◆★，这通过过氧化氢对Vero细胞的明显损伤作用得到证明■◆★◆。 对于损伤组中的Vero细胞★★■◆，MDA含量在粘附到COD微晶的过程中不断增加，这表明亚微米COD可以不断对细胞产生新的损伤。 对于对照组的Vero细胞，在与COD微晶粘附2小时后，MDA含量从2.91 nmol/mL迅速增加到8.85 nmol/mL（P0.01）。这一发现表明，COD微晶对对照组的Vero细胞造成明显的损伤■■。2小时后，MDA含量缓慢上升◆★★，变化趋势与损伤组相似。这些数据显示★■■■，2小时后，对照组COD和Vero细胞之间的粘附过程与损伤组相似。 在与COD微晶粘附过程中★◆◆■■，损伤Vero细胞中的MDA含量通常高于对照组。这一结果表明，受伤的Vero细胞受损更严重，并受到更强的氧化刺激。
Zeta电位是细胞-细胞和细胞-外部粒子相互作用的关键参数。细胞和外部颗粒之间的相互作用程度可以通过zeta电位测量来确定。 29 , 30 然而，只有少数研究使用zeta电位测量研究了细胞与CaOxa之间的相互作用◆◆★。 15 图 4D 显示了Vero细胞和COD微晶粘附过程中细胞表面的zeta电位变化★■。在粘附之前（即在0小时时），对照组和损伤组中Vero细胞的zeta电位分别为-11■◆.6 mV和-15.2 mV（P 0.01）。这一发现可能归因于两个原因。首先，损伤后细胞表面带磷脂酰丝氨酸，OPN和透明质酸等带负电荷的分子的浓度增加。其次◆■，在氧化损伤后，细胞膜上的一些不饱和脂肪酸被氧化成具有羟基和羧基的衍生物，增加了细胞表面的负电荷密度■★★★★◆。因此★◆■■，受伤细胞表面zeta电位的电荷比对照组更负。 对于对照组和损伤组的Vero细胞◆◆■★，细胞表面zeta电位在整个晶体粘附过程中呈上升趋势◆◆■◆★。这一发现表明，粘附在细胞表面的COD微晶的量与粘附时间呈正相关。粘附在细胞表面的COD微晶越多，覆盖的带负电荷的分子（例如 图 5 和 6 ）并降低电池表面上负电荷的密度★◆★◆。因此，zeta的潜力会更高。 损伤组Vero细胞上zeta电位的增加速度快于对照组★★★■■★，特别是在0-6小时时■★★★。这一发现表明COD与受损Vero细胞之间的结合速度更快，并且受损Vero细胞上粘附的COD微晶量更大■■■★■。特别是◆◆★★■★，在粘附的前6小时内，受损Vero细胞上COD微晶的粘附量显着高于对照组Vero细胞，这与SEM观察结果一致（ 图 2 和 3 ).
本研究旨在研究尺寸为150±50 nm的亚微米草酸钙二水合物（COD）与非洲绿猴肾上皮细胞（Vero细胞）损伤前后的粘附特征◆★■◆◆，并探讨肾结石形成的机制。方法 Vero细胞被过氧化氢氧化损伤，以建立损伤细胞的模型。使用扫描电子显微镜观察Vero-COD粘附。采用电感耦合等离子体发射光谱法定量测定粘附COD微晶的量。采用纳米颗粒尺寸分析仪和激光扫描共聚焦显微镜分别测定了粘附过程中Vero细胞表面zeta电位的变化和骨桥蛋白表达的变化。通过测量粘附过程中丙二醛含量和细胞活力的变化来评估细胞损伤水平◆■★■★。结果损伤组Vero细胞对COD微晶的粘附能力明显强于对照组Vero细胞。粘附到COD后，细胞活力下降■■★■◆，丙二醛含量和细胞表面zeta电位均增加★◆★，骨桥蛋白的荧光强度降低■■◆，因为骨桥蛋白分子被COD成功覆盖。亚微米COD在粘附过程中进一步破坏了细胞，特别是对于对照组中的Vero细胞，导致附着的微晶量增加★■◆◆。结论亚微米COD会在粘附过程中进一步损伤受伤的Vero细胞。附着的微晶的量与细胞损伤的程度成正比。粘附在受伤的上皮细胞上的微晶量的增加在早期肾结石的形成中起重要作用。关键词：细胞调节◆◆◆， 晶体粘附， 草酸钙二水合物， 肾结石， 病理矿化肾结石的手术治疗取得了长足的进步。然而★◆◆■，肾结石的发病率和复发率仍然很高。肾结石的主要成分是草酸钙（CaOxa）■■★★;它在健康人尿液中的浓度比没有形成肾结石时的溶解度高四倍。因此，尿石盐的过饱和度是肾结石形成的先决条件，但不是唯一的要求。 尿液流经肾小管的时间可以根据肾小管直径和长度以及尿液的流速来计算◆■。考虑到CaOxa在尿液中的生长速度◆◆■◆，游离的单微晶不能在流经小管的短时间内长成阻塞小管所需的大小。3 只有固定在肾小管上皮细胞表面的游离尿微晶才能生长并形成结石■■★★。4 ,5 具体而言■■，尿微晶与肾小管上皮细胞之间的粘附是肾结石形成的关键过程。肾小管上皮细胞损伤是促进尿微晶粘连的重要前提。4 ◆■,6 在分子和超分子水平上■◆■，肾小管上皮细胞膜的结构在CaOxa微晶◆★◆■◆★，高浓度的草酸或其他因素引起的损伤后发生变化。例如，细胞膜内带负电荷的磷脂酰丝氨酸将变为外翻，CD44和透明质酸将在细胞表面表达■◆★◆★。7 –9 这些变化为尿液微晶的成核和生长提供了有效的位点◆◆，促进了早期微结石的形成，也增强了细胞膜与尿微晶之间的粘附，加速了肾结石的形成◆★★◆■。 CaOxa一水合物（COM）是CaOxa最热力学稳定的晶型★■◆。但是■★◆★■◆，Ca2+和奥克萨2−由于 COM 与肾小管上皮细胞的粘附力更强■■■，因此在过饱和尿液中常沉淀为 CaOxa 二水合物 （COD），这会对细胞造成更严重的损害。因此，尿液中危害相对较小的COD晶体的沉淀是生物体的一种自我保护。这也揭示了COD微晶与人体内肾小管上皮细胞之间存在粘附。 然而，目前对肾小管上皮细胞与晶体粘附的研究主要集中在微米级COM和COD晶体上。6 , 11 只有少数关于尿液中纳米晶体的研究可用， 12 , 13 肾小管上皮细胞与大小小于200nm的CaOxa晶体之间的相互作用尚未报道■■。事实上，尿液中存在许多亚微米微晶，这些微晶是微米级晶体形成的基础■★■■。因此，本研究研究了尺寸为150±50 nm的COD微晶与非洲绿猴肾上皮细胞（Vero细胞）的粘附，以进一步了解肾结石形成的分子和细胞机制■★◆■◆。
维罗细胞 （4 × 105将细胞/ mL）接种在六孔板（2mL /孔）中◆★■■，然后用COD悬浮液共培养不同时间★◆■。用D-Hank溶液洗去非粘附晶体，加入含0.02%乙二胺四乙酸消解液的0★★■■.25%胰蛋白酶。将细胞吹干成单细胞悬浮液，然后以1000rpm离心3分钟■★。除去上清液◆★■◆■★，然后将细胞和晶体重悬于1000μL D-Hank溶液（pH 7.86）中。将约800μL悬浮液注入样品池中，以使用纳米颗粒分析仪测量zeta电位◆★★■。
使用IBM SPSS 16◆★★◆■.0软件（SPSS Inc，芝加哥，IL）对实验结果进行了统计分析。使用Tukey测试分析实验组和对照组之间的均值差异。P0.05时差异显著■★，P0.01时差异极显著★◆◆■◆，P0.05时差异不显著。除ICP检测外★◆■，所有实验至少独立进行三次。
图4A 显示了Vero细胞和亚微米COD之间粘附过程中细胞活力的变化。随着粘附时间从0 h增加到24 h，对照组Vero细胞活力从100%下降到52.4%（P0★◆◆★◆.01），而损伤Vero细胞的存活率从70.5%下降到49%（P 0.01）。结果表明，COD微晶在粘附过程中对细胞造成进一步的损伤，从而降低了细胞活力。特别是★◆，对照组Vero细胞的存活率在0~6小时内迅速下降，表明COD对对照组Vero细胞造成严重损伤。
图1 通过（A）扫描电子显微镜（比例尺= 1μm）◆◆■★■，（B）X射线衍射和（C）傅里叶变换红外光谱分析超细草酸钙二水合物微晶的形貌和组成★◆◆。 通过XRD和FT-IR证实了所制备晶体的组成。XRD 模式 （图 1B ）证明这些晶体是COD晶体。图案中的晶面间距（d值）分别为0.873、0.618、0.442◆★■★、0.278和0◆★◆.224 Å◆◆■◆★★，分别对应于COD的（110）◆★■、（200）、（211）、（411）和（213）平面■◆■★。14 傅立叶变换红外光谱（图 1C 的晶体在3453 cm处显示出强烈的单一吸收峰★■。−1，这与3000厘米内出现的COM晶体的多个峰有显着差异■■◆■★★。−1至 3600 厘米−1具有多个峰值的区域。16 不对称拉伸振动如（首席运营官−）的羰基出现在1647厘米处−1，而 us（首席运营官−） 出现在 1328 厘米处−1★■■◆.两个峰值都表明只有COD晶体的存在■◆◆。也就是说◆★★■◆■，XRD和FT-IR结果证明所制备的晶体是纯COD并且没有任何COM。
将Vero细胞接种在六孔板（4×105细胞/ mL，2 mL /孔），底部有盖玻片◆■★◆，然后与COD悬浮液一起孵育不同时间◆■★◆★■。如前所述，通过LSM用OPN一抗和荧光素异硫氰酸酯二抗观察到OPN表达。
OPN是一种磷酸化糖蛋白，具有丰富的唾液酸，分子量为60-80 kDa。 24 , 25 OPN是肾结石中重要的有机基质之一。动物实验和细胞模型实验都表明★◆，OPN表达可以促进肾结石的形成。 24 通过LSM观察了VERO-COD粘附过程中OPN的表达◆★■★■■。LSM图像是重复三次重复的实验的总体平均结果。具有代表性的LSM图像显示在 图 5 和 6 ★■★，定量分析结果显示在 图 4C ★■◆◆★■.
